O controle homeostático dos níveis de sódio e água, e da pressão sangüínea envolve uma complexa interação hormonal e neural. Nos últimos 30 anos diversos estudos se voltaram à análise da participação do coração neste mecanismo. 

A cobaia (Cavia porcellus) é um modelo funcional e anatômico muito utilizado em pesquisas relacionadas ao coração (ALEZAIS, 1903; DUMAS, 1953; FROGER, 1966; COOPER & SCHILLER, 1975; CHIMOSKEY et al., 1984), destacando-se aqui aquelas referentes as atividades neuroendócrinas. Na literatura há referências a numerosos trabalhos com diferentes enfoques quanto aos mecanismos morfofuncionais da atividade cardíaca: inervação autonômica do miocárdio, o sistema de condução, o plexo cardíaco subepicárdico e um número tão extenso quanto variado de trabalhos referentes as atividades endócrinas do coração.

O primeiro relato na literatura sobre este tema aponta a presença de grânulos semelhantes aqueles de secreção nos átrios e aurículas do coração (KISCH et al. 1956). A partir deste trabalho surgiram outros que demonstraram a presença de grânulos específicos localizados nos miócitos atriais. PALADE (1961) descreveu esses grânulos como medindo entre 100-250nm de diâmetro, contendo material denso, homogêneo ou finamente granular, envolvido por membrana, sem se ater, entretanto, à sua natureza secretória. Foi a partir das pesquisas de DE BOLD et al. (1981), que o problema foi melhor equacionado. Estes autores, injetando extratos de átrios em ratos, observaram que ocorria um grande aumento na diurese com excreção renal de sódio, diminuição da pressão arterial e aumento do hematócrito; o mesmo não acontecia ao se injetar extrato de ventrículo. Neste mesmo trabalho DE BOLD sugere a denominação desta substância desconhecida como Fator Natriurético Atrial (FNA). Posteriormente, outros autores passaram a denominar diferentemente esta mesma substância: cardionatrina (FORSSMANN et al., 1983), auriculina (MAACK et al., 1984), e atriopeptina (CURRIE et al., 1984), diferindo entre si pelo tamanho da cadeia de aminoácidos.

Todos os trabalhos relacionados às atriopeptinas serviram para definir o coração como um órgão endócrino, no sentido clássico da palavra, isto é, o coração responde a estímulos funcionais, como a distensão das paredes atriais, aumento do volume intravascular ou taquicardia, liberando na corrente sanguínea sua mensagem química que atua em diversos órgãos (AARDAL & HELLE, 1991).

A atriopeptina é sintetizada e armazenada em grânulos atriais específicos localizados no sarcoplasma perinuclear intimamente associados às mitocôndrias e à superfície do retículo endoplasmático liso na região de Golgi (PALADE, 1961). Modernas técnicas bioquímicas foram utilizadas para extrair, purificar e identificar quimicamente este peptídeo. A forma circulante no homem é uma cadeia de 28 aminoácidos (KANGAWA & MATSUO, 1984), que é idêntica à do cão (OIKAWA et al., 1985) mas é um pouco diferente nos roedores (FLYNN & DAVIES, 1985). 

É vasta a literatura a respeito das atriopeptinas, que tratam sobre fatores que afetam sua secreção, efeitos sobre a função renal, efeitos sobre outros hormônios e efeitos sobre o sistema nervoso central. Entretanto, ainda não foi equacionado satisfatoriamente o mecanismo de liberação deste fator para a corrente sanguínea.

A compreensão dos mecanismos envolvidos no controle da secreção cardíaca tem como uma das premissas fundamentais o conhecimento minucioso da morfologia das estruturas musculares e nervosas envolvidas, inclusive os plexos nervosos do coração responsáveis pela liberação de diferentes neuropeptídeos. Assim, nos deparamos com a falta de dados descritivos a respeito da morfologia do plexo subepicárdico e o arranjo tridimensional da musculatura principalmente das aurículas, elementos estes que estão diretamente relacionados aos mecanismos de secreção do fator natriurético atrial. 

2. Literatura

KISH (1956) ao analisar o coração da cobaia, descreveu a presença de corpúsculos envolvidos por membrana dupla, com o diâmetro aproximado de 200 Å, encontrados apenas nas aurículas. 

PALADE (1961) descreveu a presença de numerosos grânulos nos miócitos atriais de ratos. Segundo este autor, estes grânulos medem de 100 a 200mµ de diâmetro e localizam-se na região perinuclear, próximo à mitocôndrias e ao complexo de Golgi e são raramente encontrados nos miócitos dos ventrículos. 

JAMIESON & PALADE (1964) em seus estudos em corações de rato, camundongo, cachorro, gato e humano, observaram a presença de grânulos eletrondensos no complexo átrio-auricular e sua ausência nos miócitos ventriculares. Descreveram que estes grânulos estavam mais concentrados na região perinuclear e em íntima associação com o complexo de Golgi, sugerindo que tais estruturas poderiam apresentar natureza secretória. 

BERGER & RONA (1971) propuseram uma tipificação dos grânulos atriais em tipos A, B, C e D, onde os do tipo A possuem conteúdo muito denso e algumas vezes retraído, deixando um halo entre este e a superfície interna da membrana; os do tipo B apresentam-se pálidos e fibrogranulares; os do tipo D caracterizam-se pelo menor diâmetro e conteúdo denso e os do tipo C são corpos residuais. 

MAGUIRE (1972) analisou a superfície endocárdica e os forames venosos mínimos das câmaras cardíacas de camundongos. Seus estudos demonstraram que o endocárdio é uma entidade complexa e de estrutura específica, onde suas células de diferentes aspectos morfológicos (amplas margens e projeções) o diferem consideravelmente do endotélio vascular. Os orifícios venosos encontrados aprerentava diferentes diâmetros. Concluiu sugerindo que os forames de menor diâmetro podem representar artefato de técnica, visto que durante a preparação para microscopia eletrônica de varredura pode ocorrer enrugamentos da superfície endocárdica.

CANTIN et al. (1979) estudaram diferentes espécies de mamíferos (camundongo, rato, hamster, cobaia, coelho, gato jovem e idoso) e observaram que o número de grânulos atriais específicos foi maior no átrio direito do rato e menor no átrio direito da cobaia. No hamster, coelho e gato jovem, o átrio esquerdo apresentava maior número de grânulos. 

DE BOLD et al. (1981) analisaram em ratos os efeitos da administração de extrato atrial e ventricular, e observou que nos animais que receberam o extrato atrial ocorreu uma rápida elevação na excreção de sódio (trinta vezes mais), urina (dez vezes mais) e potássio (duas vezes mais). Não observaram o mesmo efeito após a administração de extrato ventricular. Concluiram que o extrato atrial continha um potente inibidor da reabsorção renal de NaCl. 

FORSSMANN et al. (1984) estudaram o complexo átrio-auricular de cachorro e verificaram que as células atriais produzem e armazenam um peptídeo, a cardiodilatina. Avaliando seus efeitos sobre a musculatura lisa das artérias aorta, renal e mesentérica inferior e sobre as funções renais, observaram que a aorta apresentou-se mais sensível à ação vasorelaxante do peptídeo. A cardiodilatina mostrou ainda potente ação diurética e natriurética. 

VARESS & SONNERBERG (1984) observaram em em ratos que a remoção da aurícula direita reduz a liberação do fator natriurético atrial (FNA) na ocorrência de hipervolemia.

BIANCHI et al. (1985) através de radioautografia, detectaram a presença do FNA na glândula supra-renal, nos hepatócitos, vilosidades intestinais, na camada muscular dos colos, células epiteliais do corpo ciliar, vasos renais e pulmões de ratos. Os autores sugeriram que a presença do FNA nestes órgãos indica importantes efeitos hemodinâmicos nos rins, pulmões, fígado e glândulas supra-renais, e ação também na regulação da água e transporte de íons no intestino delgado, e também efeitos metabólicos no fígado. 

CHAPEAU et al. (1985) observaram através de marcação imunohistoquímica e  imunocitoquímica a presença do FNA (porção C-terminal) no complexo átrio-auricular de mamíferos (rato, camundongo, cobaia, hamster, coelho, gato, cachorro e humano), bem como em anfíbios (rã) e peixes. Registraram que a aurícula direita do rato apresentava maior intensidade de marcação, e que o complexo do lado direito continha maior número de grânulos que o esquerdo. De modo geral, observaram que o gradiente de densidade de grânulos era decrescente da superfície subepicárdica ao endocárdio.

DE BOLD (1985) na sua revisão da literatura, sugere que o FNA desempenharia suas funções regulatórias de acordo com as necessidades de cada espécie.

PAGE et al. (1986) em seus estudos em camundongos, conseguiram evidenciar através de secções ultrafinas e criofratura, as bases ultra-estruturais do processo de exocitose do FNA. Segundo esses autores, a fusão dos grânulos atriais contendo o hormônio com as caveolas seriam o caminho para a sua extrusão.

PARDINI et al. (1987) descreveram a localização, distribuição e projeções dos neurônios dos gânglios intracardíacos de ratos, através de marcação retrógrada. Eles descreveram quatro grupos distintos: a- entre a veia cava superior e a aorta; b- septo interatrial (parte superior); c- parede posterior do átrio esquerdo e d- septo interatrial (parte inferior). Os autores sugeriram uma relação entre estes neurônios e o sistema de condução do coração.

IIDA et al. (1988) estudaram os efeitos da monensina sobre a  cinética dos grânulos atriais. Seus achados mostraram que a monensina estimula a interação entre os grânulos atriais e os microtúbulos, promovendo um deslocamento dos grânulos das regiões perinucleares em direção à periferia celular. 

GOETZ (1988) descreveu os efeitos da atriopeptina nos sistemas cardiovascular, renal, endócrino e neural, destacando que, provavelmente, a atiopeptina agiria de maneira interativa com diversos órgãos de modo a regular as funções cardiovasculares e o balanço hídrico do corpo. 

SKEPPER et al. (1988) analisaram a aparente heterogeneidade dos grânulos atrias específicos em ratos e sugeriram que as variações na ultra-estrutura e na intensidade da marcação imunocitoquímica seriam devidas aos diferentes ângulos de secção através dos grânulos.

WILDEY et al. (1988), a partir de seus estudos em ratos, concluiram que a ativação do FNA não é um evento intracelular,  mas que ocorresse provavelmente após a liberação do pró-hormônio.

GILLOTEAUX  (1989) em seus estudos sobre o endotélio de ratos (embriões), propôs que este revestimento seria um local de transporte e ativação do FNA, antes de sua liberação na corrente sanguínea. 

SKEPPER et al. (1989) utilizaram ratos em tres tipos de experimentos, a fim de analisar o comportamento do FNA. Um grupo de animais foi submetido a uma vagotomia cervical bilateral, outro grupo a uma expansão volumétrica das paredes atriais e terceiro grupo, a uma combinação de expansão volumétrica e vagotomia. A análise da concentação FNA imunoreativo demonstrou que havia uma diminuição desta concentração no complexo do lado direito frente a uma expansão volumétrica e vagotomia bilateral isoladamente. Entretanto, a combinação da expansão e vagotomia provocava uma substancial diminuição desta concentração em ambos os lados. As análises ultra-estruturais mostraram que nos animais submetidos a uma expansão volumétrica, os grânulos atriais específicos encontravam-se em maior concentração na periferia celular. Não observaram evidências de fusão com as cavéolas ou túbulos-T. Nos animais submetidos à vagotomia, ocorreu uma diminuição pronunciada no número de grânulos no complexo átrio-auricular direito, sendo mais marcante no grupo de animais submetido a expansão mais vagotomia. 

THIBAULT et al. (1989) analisaram em ratos o processo de clivagem do FNA, e obervaram que este processo não acontecia nem no complexo de Golgi e nem nos grânulos.

AARDAL & HELLE (1991) fizeram uma revisão sobre os aspectos endócrinos do miocárdio e destacaram que a regulação do excesso de volume sanguíneo parece ser mediado pelas atriopeptinas que relaxariam a musculatura lisa da aorta e outras artérias de grande calibre. Relataram ainda que, além de sua ação natriurética, estas atripeptinas também promoveriam uma perda líquida via intestinal. 

CHO et al. (1991), sugeriram em seus estudos em coelhos, que o principal estímulo para liberação do FNA seria o encurtamento das fibras musculares atriais. 

MERCEDES et al. (1991) analisaram os efeitos das modificações do cálcio intracelular na liberação do FNA e concluíram que este íon, embora indispensável no processo de excitação-contração, não é essencial na liberação basal do FNA.

GILLOTEAUX et al. (1991) estudaram em hamsters (feto, neonato e adulto), através de imunomarcação ultra-estrutural, a trajetória do FNA do miócito atrial até a corrente sanguínea. Confirmaram que o FNA é liberado na circulação via exocitose e que o revestimento endotelial pode desempenhar um papel importante no transporte, ativação e liberação deste hormônio. 

LACHANCE & GARCIA (1991) avaliaram em ratos, os efeitos da estimulação adrenérgica e da pressão das paredes atriais na liberação do FNA. Propuseram que cada umas destas situações pode, de per se, induzir a secreção deste hormônio, e que as duas situações ocorrendo concomitantemente, potencializariam suas respostas secretórias. 

MOUTON (1992) sugere que os conhecimentos obtidos sobre o coração como órgão endócrino devem se voltar não apenas para a elucidação de seus mecanismos de ação, mas também para uma elaboração e desenvolvimento de terapêuticas mais racionais nas desordens circulatórias. 

SCHIEBINGER & GREENING (1992) analisaram a interação entre o estímulo mecânico e hormonal na liberação do FNA, utilizando norepinefrina, endotelina e vasopressina. Verificaram que a endotelina aumenta a secreção do FNA como resposta à distensão das paredes do complexo átrio-auricular durante o aumento volumétrico do plasma.

SEUL et al. (1992) observaram em ratos, que o aumento do volume e consequente distensão-redução das paredes do complexo átrio-auricular, produziam um aumento na secreção do FNA predominantemente no complexo do lado direito. Inferiram que o complexo direito e o esquerdo poderiam ter diferentes mecanismos de controle, no que se refere à homeostase do volume líquido do corpo. 

STEWART et at. (1992) concluíram em seus estudos em cachorros, que a retirada bilateral das aurículas elimina a liberação do FNA e bloqueia a excreção renal de água e sódio frente a um aumento agudo do volume plasmático. Eles sugerem que esta resposta é resultado das alterações mecânicas nas paredes do complexo átrio-auricular devido ao aumento rápido do volume plasmático.

AVRAMOVITCH et al. (1995) analisaram as características morfométricas dos grânulos atriais específicos, em modelo experimental de insuficiência cardíaca congestiva desenvolvido em ratos, e observaram que a quantidade de grânulos próximo à superfície celular aumentava em relação àqueles próximos ao complexo de Golgi, e que havia um percentual maior de grânulos pequenos em relação aos de maior diâmetro.

PAUZA et al. (1997) estudaram em ratos e cobaias os aspectos morfológicos do plexo do hilo do coração, localizado abaixo das artérias pulmonares. Ao contrário do plexo cardíaco subepicárdico, este plexo não se encontra recoberto pelo epicárdio. Os autores relataram a existência de dois tipos celulares envolvidos, neurônios unipolares e multipolares, não relacionando entretando, esses achados à função.

YOSHIHARA et al. (1998) analisaram pacientes submetidos à cirurgia cardíaca para tratamento da fibrilação atrial (“cirugia de Cox” ou maze procedure), a fim de avaliarem as causas da retenção de líquido típica do pós-operatório imediato deste tipo de procedimento cirúrgico. Verificaram que os pacientes apresentavam uma diminuição na concentração do FNA no plasma sanguíneo no pós-operatório e mesmo em períodos crônicos, e que esta diminuição provavelmente reduziria as respostas dos rins à hipervolemia. 

3. Proposições

Nos propomos neste trabalho a analisar os seguintes aspectos do complexo átrio-auricular em cobaias: 

1.      Estudar tridimensionalmente a arquitetura do miocárdio, através de preparações laminares. 

2.      Estudar a microvasculatura, através do método de microscopia eletrônica de varredura. 

3.      Estudar o relevo da superfície endocárdica, através do método de microscopia eletrônica de varredura.

4.      Estudar a ultra-estrutura dos miócitos, através do método de microscopia eletrônica de transmissão. 

5.      Estudar a permeabilidade do espaço intercelular, através de técnicas topo-citoquímicas analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão.

6.      Estudar o plexo nervoso subepicárdico, através dos métodos de marcação pelo NADH e Acetilcolinesterase.

7.      Estudar a presença e localização do fator natriurético atrial, através dos métodos de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

8.      Comparar morfometricamente as superfícies endocárdica e epicárdica. 

4. Materiais e Métodos

Foram utilizadas cobaias (Cavia porcellus), jovens a adultas de ambos os sexos, pesando entre 500-700g, doadas pela Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e a Pesquisa da Faculdade de Medicina  da Universidade de São Paulo.

4.1. Arquitetura do miocárdio

Para a análise da arquiteura das fibras musculares do complexo átrio-auricular utilizamos cinco animais que foram anestesiados e sacrificados após exposição por cerca de 5 minutos  em câmara de saturação com éter sulfúrico. Após abertura da caixa torácica, exposição do coração e secção da veia cava caudal, as câmaras cardíacas foram lavadas com solução salina (NaCl 0,9%), através dos ventrículos. Em um animal foi injetado alginato (material elástico para impressão) nos átrios com o objetivo de manter a forma das cavidades atriais mesmo estando vazias. O preparado anatômico foi fixado com formol a 10% em  tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 7,3), por 5 dias. Os corações foram cuidadosamente removidos e os ventrículos retirados através de uma secção imediatamente abaixo do sulco coronário. O Jeltrate foi retirado da cavidade atrial após uma secção frontal de suas paredes e em seguida, os átrios foram corados como preparado total de membrana pela técnica do Azo-carmim B (1g:200ml) para evidenciação das fibras musculares, e a seguir, procedeu-se à desidratação em série crescente de álcoois e posterior diafanização pelo benzol. Para o exame do arranjo dos feixes de fibras musculares, as cavidades foram amplamente abertas e observadas ao microscópio estereoscópico Zeiss com aumento de 4 a 20 vezes e fotografado em sistema de análise de imagem1.

4.2. Arquitetura da rede vascular

Para o estudo da angioarquitetura do complexo átrio-auricular 5 corações foram perfundidos com solução tampão heparinizada (1mg:300ml), foi injetado, através da aorta, resina a base de metacrilato (Mercox), que apresenta um grau de retração de menos de 1%. Os blocos coração-pulmão foram retirados e colocados em água a 40-50º C, durante 2 horas, para polimerização da resina. O material foi imerso em solução de KOH a 20% até a completa corrosão dos tecidos, sendo o molde resultante, lavado em água; após secar à temperatura ambiente, os moldes foram montados em suportes metálicos e metalizados com ouro usando o aparelho Balzers-CSD-240. O exame foi realizado em microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM-6100, pertencente ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. 

4.3. Superfície endocárdica

Para análise da superfície interna dos átrios e aurículas, 6 animais foram perfundidos através dos ventrículos com uma solução de NaCl 0,16M, KCl 5,97nM e MgCl 10nM (GRONINGEN et al. 1991) com heparina (1mg:300ml), sendo mantidos imersos na mesma solução por mais 20 minutos. O objetivo dessa técnica foi o de promover um relaxamento muscular, a fim de se evitar enrugamentos na superfície interna dos átrios e aurículas. Logo após, foi injetada, através dos ventrículos, uma solução fixadora constituída de 2,5% de glutaraldeído, 2,0% de paraformaldeído em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,3.  Os corações foram seccionados no nível do plano valvar e os conjuntos átrio-auriculares mergulhados no mesmo fixador a 4ºC por cerca de uma semana. A superfície interna dos átrios e aurículas foi então exposta, lavada com o auxílio de uma seringa, com solução tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 7,3). Os preparados totais foram desidratos em série crescente de álcoois a partir do 70º e secos pelo método do ponto crítico do CO₂, em um aparelho Balzers-CPD-010, montados em suporte apropriado e metalizados com ouro através de um aparelho Balzers-CSD-240. O exame dos espécimes foi realizado em um microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM 6100 do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo.

4.4. Ultra-estrutura 

Análise dos aspectos ultra-estruturais dos miócitos atriais foi feita de acordo com o seguinte protocolo: após anestesia de 3 animais com éter sulfúrico, procedeu-se à perfusão com solução salina heparinizada (1mg/300ml de solução), através dos ventrículos. Os átrios e aurículas foram reduzidos a fragmentos de cerca de 1 mm³. Alguns fragmentos foram fixados em glutaraldeído a 5% em tampão cacodilato (0,2M, pH 7,3) e outros fragmentos, em solução Karnovsky (parafolmaldeído 8%, glutaraldeído 50%, em tampão cacodilato-0,2M, pH 7,2) mais 25 mg de CaCl₂, durante 3 horas. Os fragmentos foram lavados 3 vezes em tampão cacodilato (0,1M, pH 7,3) por 5 minutos cada, e pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% e a 2% em tampão cacodilato (0,1M, pH 7,3), durante 2 horas. Os fragmentos foram deixados à noite em solução de acetato de uranila a 0,5% com sacarose (540mg/100ml) e após lavagem em tampão cacodilato, foram desidratados em série crescente de álcoois (álcool 70º, álcool 70º + uranila à 1%, álcool 95º, álcool 100º e óxido de propileno) e incluídos em resina Epon[1], com embebição prévia ema solução 1:1 de resina mais óxido de propileno, durante 8 horas, sob rotação. A seguir, foram embebidos em resina pura durante 5 horas e finalmente incluídos na mesma, em formas de silicone a 60º C, durante 5 dias.  Cortes ultrafinos foram obtidos com faca de diamante, em ultramicrótomo2 e após contrastação com acetato de uranila e citrato de chumbo foram analisados em um microscópio eletrônico de transmissão Philips EM 400 do Laboratório de Investigação Médica da Faculdade de Medicina da USP (FMUSP) e Philips EM 301, do Instituto do Coração, da[2]FMUSP.

4.5. Análise do espaço intercelular

Com a finalidade de estudar as superfícies e espaços entre as células para a verificação de sua capacidade potencial de permeabilidade, foram usadas as seguintes técnicas topo-citoquímicas: vermelho de rutênio, azul alcian e lantânio, que serão descritos a seguir.

4.5.1. Vermelho rutênio

Fragmentos de átrios e de aurículas de 3 animais foram fixados em solução aquosa de glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato (0,2 M, pH 7,3) com solução de vermelho rutênio1 (10 mg/10 ml de água destilada), em partes iguais, durante 1 hora, em temperatura ambiente. Após 3 lavagens, de 5 minutos cada, em tampão cacodilato com 7,5% de sacarose, os fragmentos foram pós-fixados numa solução de partes iguais de tetróxido de ósmio a 5% em água, tampão cacodilato (0,2 M, pH 7,3) e solução estoque de vermelho rutênio, durante 3 horas. Posteriormente, os mesmos foram novamente lavados em tampão cacodilato, 3 vezes por 5 minutos, e deixados à noite em solução de acetato de uranila 0,5% mais sacarose (540mg/100ml). Seguiram-se os procedimentos de rotina para microscopia eletrônica de transmissão, como já referido anteriormente quando da descrição da ultra-estrutura.

4.5.2. Azul alcian

Os fragmentos procedentes de 3 animais foram fixados em solução de glutaraldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (0,2M, pH 6,5) mais 1% de azul alcian2, durante 12 horas, pós-fixados em tetróxido de ósmio 2% em tampão fosfato de sódio, durante 2 horas e deixados à noite em solução de acetato de uranila a 0,5% mais sacarose. Entre cada passo os fragmentos foram lavados 3 vezes durante 5 min. O material foi deixado à noite em solução de acetato de uranila 0,5% mais sacarose (540mg/100ml) e então emblocado em resina Epon, segundo procedimento descrito anteriormente.

4.5.3. Lantânio

Os fragmentos dos átrios e aurículas de 3 animais foram fixados em solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato (0,2M, pH 7.2) mais 1% lantânio1, durante 36 horas, a 4º C. Após 3 lavagens, de 5 minutos cada em tampão fosfato de sódio (0,2M, pH 7,2), foram pós-fixados em tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato de sódio, durante 1 hora. A seguir foram lavados novamente em tampão cacodilato, 3 vezes de 5 minutos cada, e deixados à noite, em solução de acetato de uranila a 0,5% mais sacarose (540mg/100ml). Os espécimens foram emblocados em resina Epon como já descrito em item anterior.

4.6. Plexo nervoso subepicárdico

4.6.1. Reação histoquímica para NADH

Para análise do arranjo, quantificação, morfologia e tamanho (área do perfil celular) dos neurônios e dos gânglios do plexo cardíaco, foi utilizada a técnica de marcação do NADH (GABELLA, 1987) no coração de 5 animais. Após a anestesia pelo éter sulfúrico, os animais foram perfundidos com solução de Krebs (NaHCO₃ - 1,30g; MgCl₂ anidro - 0,114g; CaCl₂ anidro - 0,27g; NaH₂PO₄H₂O - 0,165g; KCl 0,43g; NaCl - 7,05g e Glucose - 2,071g por litro), a fim de manter a vitalidade dos tecidos. Aberta a cavidade torácica, as câmaras atriais foram preenchidas, através dos ventrículos, com Jeltrate, elastômero já referido. Os blocos de coração-pulmão foram retirados e a seguir, por dissecção, os átrios e aurículas foram separados dos ventrículos, com a retirada do tecido adiposo e conjuntivo adjacentes. O complexo átrio-auricular foi deixado em solução de Krebs por 30 min, sendo depois colocado em solução de Triton-X (0,3% em solução de Krebs) por 10 minutos, agitando-se levemente, e então lavado por 3 minutos em 4 passagens pela solução de Krebs.

A seguir, o complexo átrio-auricular foi mantido na solução de incubação (25 partes de solução estoque 0,5mg/ml de Nitroblue Tetrazolium em H₂O destilada, 25 partes de tampão fostato 0,1M pH 7,3, 50 partes de água destilada e 0,5 mg/ml de b-NADH diaforase- Gabella, 1987) por 45 minutos, sendo a reação monitorada através de microscópio estereoscópico. Decorrido este tempo, a reação foi interrompida pela fixação do material em formol tamponado (tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,3) a 10%. As peças foram reduzidas a preparados totais de membrana através de dissecção sob microscópio estereoscópico, e em seguida lavadas em água destilada, montadas entre lâmina e lamínula em solução de glicerina tamponada (tampão fosfato de sódio 0,2M, pH 7,3) a 70º e examinadas ao microscópio de luz.

A contagem do número total de neurônios presentes nos átrios foi feita ao microscópio de luz,  com ocular de 10X e objetiva de 40X. 

O tamanho dos corpos dos neurônios (área do perfil da projeção do corpo dos neurônios) foi determinado utilizando-se um programa de análise de imagem KS-300, associado a um microscópio Zeiss, com aumento de 40X.

4.6.2. Reação à Acetilcolinesterase

Para a demonstração histoquímica da acetilcolinesterase foi utilizado o método de KARNOVSKY E ROOTS (1964). Cinco animais foram anestesiados com éter sulfúrico, sacrificados e perfundidos com solução salina heparinizada.  As câmaras atriais foram preenchidas com Jeltrate, através dos ventrículos, de modo a distender as paredes atriais e auriculares, e permitir o contato de toda a superfície externa com as soluções. Os corações foram imersos em solução de paraformaldeído a 2% em tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 6.0), mais 0,25% Triton 100-X, durante 12 horas, a 4ºC. Após 2 horas o material foi dissecado ao microscópio estereoscópico, retirando-se o molde de Jeltrate e também grande parte da musculatura dos átrios, a fim de obter preparações laminares. Estas preparações foram imersas em solução de lavagem constituída de 60g de sacarose, 200 ml de água destilada e 2 g de goma arábica em pó, onde permaneceram durante 12 h. Posteriormente as peças foram imersas numa solução de Isoompa (0,00685g de Isoompa em 5 ml de água destilada), durante 20 min, e deixados em estufa a 37º C, durante 24 horas, numa solução contendo 5 mg de iodeto de acetiltiocolina, 6,5 ml de tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 6,0), 0,5 ml de citrato de sódio, 1 ml de sulfato de cobre (30 mM), 1 ml de água destilada e 1 ml de ferricianeto de potássio (5 mM). Em seguida procedeu-se à desidratação por meio de duas passagens em álcool absoluto, 3 minutos cada uma, diafanizaço em xilol, com duas passagens de 3 minutos cada e montagem em resina sintética (Entellan-Merck), entre lâmina e lamínula, com a superfície externa do complexo átrio-auricular para cima. Análise do material foi feita em fotomicroscópio.

4.7. Presença e localização do Fator Natriurético Atrial

Para analisar a presença, localização e características do Fator Natriurético Atrial (FNA) nos miócitos do complexo átrio-auricular, os seguintes procedimentos foram utilizados:

4.7.1. Microscopia de luz

Foram utilizados 4 animais que foram sacrificados, após anestesia pelo éter sulfúrico, e os corações imediatamente retirados, lavados rapidamente em tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 7,3) e, em seguida, imersos na solução fixadora (8% paraformaldeído, 0,2% ácido pícrico, tampão fosfato de sódio-0,1M, pH 7,3). Após a remoção dos ventrículos, dois dos átrios foram seccionados sagitalmente e os outros dois, transversalmente.  Os átrios foram fixados por 7 horas, a 4º C, no mesmo fixador, e após lavagem em solução tampão, foram incluídos em parafina a uma temperatura inferior a 60ºC. Cortes semi-seriados de 7µm foram colocados em lâminas tratadas com alúmen crômico mais gelatina e deixados em estufa por uma semana.

O método imuno-histoquímico utilizado foi o da peroxidase-antiperoxidase (JANICE & BEURNE, 1983) para análise ao microscópio de luz. O material foi colocado numa solução de 0,3% de H₂O₂ em tampão fosfato de sódio (0,001M, pH 7,3), durante 20 minutos, a temperatura ambiente, para bloquear a peroxidase endógena. Os cortes foram lavadas em tampão fosfato de sódio (0,01M, pH 7,3), 1% tampão Tris HCl (0,01M, pH 7,3), e 0,25% Triton X-100; incubado em soro normal de coelho1 (diluição 1:20), durante 20 minutos, à temperatura ambiente; incubado durante 24 horas, a 4º C, em anticorpo primário1 desenvolvido em cabra (diluição 1:200); lavados em tampão fosfato de sódio, Tris HCl, Triton; incubados durante 4 horas, à temperatura ambiente, em anticorpo secundário (Anti-Goat IgG³) desenvolvido em coelho (diluição 1:50). Após a lavagem em tampão fosfato de sódio, Tris HCl e Triton, os cortes foram incubados no complexo peroxidase anti-peroxidase2 desenvolvido em cabra (diluição 1:50), durante a noite, à temperatura ambiente e em câmara escura. A revelação foi feita pelo DAB-H₂O₂ (6mg:10ml). A especificidade da imunomarcação foi controlada excluindo o anticorpo primário nas lâminas controle. O material foi analisado ao microscópio de luz, sob diversos aumentos.

4.7.2. Microscopia eletrônica de transmissão

De 3 animais sacrificados após anestesia pelo éter, foram retirados os corações que foram lavados com solução salina. Fragmentos de átrios e aurículas foram fixados por imersão, parte dos quais em paraformaldeído a 8% e ácido pícrico a 0,2% em tampão fostato (0,1M, pH 7,3) e parte em paraformaldeído a 6%, glutaraldeído a 0,5% e ácido pícrico a 0,2% em tampão fostato (0,1M, pH 7,3), durante 4 horas, a 4º C. O material foi parcialmente desidratado, metade dos fragmentos apenas em álcool 70º e a outra metade em álcool 70º e 95º; todos os fragmentos foram embebidos, sem prévia passagem pelo ósmio, em resina LR White3. A polimerização da resina foi obtida em estufa a 50º C durante 48 horas. Cortes ultrafinos foram obtidos com faca de diamante e colocados em telas de níquel revestidas com formvar. Os sítios de ligação inespecífica foram bloqueados utilizando-se uma solução de Tris HCl (0,02M, pH 7,2) contendo 2% de soro bovino, 0,2% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100, durante 90 minutos.  A seguir, as telas foram submetidas a diversas soluções preparadas com água desmineralizada. Inicialmente foram incubadas durante 18 horas, a 4º C em câmara úmida, no anticorpo primário1 desenvolvido em cabra, diluído em Tris HCl (0,02M, pH 7,2), 2% de soro bovino, 0,2% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100 (diluição 1:50). A seguir, foram lavadas em Tris HCl (0,02M, pH 7,2) contendo 0,1% de soro bovino, 0,2% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100, por 1 min; tampão Tris HCl, 1 minuto e finalmente submetidos a 10 lavagens em tampão Tris HCl no período de 1 hora. O material passou novamente pelo processo de bloqueio dos sítios de ligações inespecíficas, utilizando-se a solução de Tris HCl (0,02M, pH 7,2) contendo 2% de soro bovino, 0,2% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100, durante 10 minutos. As telas foram incubadas por 1 hora em Proteína-A Gold2 diluída em Tris HCl (0,02M, pH 7,2) contendo 2% de soro bovino, 0,2% de Tween 20 e 0,1% de Triton X-100. O material foi lavado em Tris HCl (0,02M, pH 7,2) contendo 0,1% de soro bovino, 0,2% de Tween 20, 0,1% de Triton X-100, por 1 min; tampão Tris HCl, 1 minuto e 10 lavagens em tampão Tris HCl no período de 1 hora. Finalmente as telas foram lavadas em água bidestilada. O grupo controle foi obtido pela omissão do anticorpo primário. As telas foram contrastadas com acetato de uranila por 5 minutos e analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão, Philips EM 400,  Faculdade de Medicina da USP.

4.8. Comparação morfométrica entre as superfícies interna e externa do complexo átrio-auricular

Foram utilizados 5 animais que foram anestesiados e sacrificados conforme procedimentos descritos anteriormente, e os corações foram retirados e fixados em uma solução de paraformaldeído a 10% em tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 7,3), por 48 horas. Os ventrículos foram separados dos complexos átrio-auriculares que foram seccionados de acordo com diferentes planos de orientação (3 em secção frontal, 1 secção sagital, e em outro, secção transversal) e incluídos em parafina. Cortes com 7µm de espessura (num total de 50 para cada coração) foram corados pelo método de tricômico de Masson. Destas 50, foram selecionadas 5 lâminas de cada conjunto, uma a cada dez, passando por níveis mais ou menos equidistantes abrangendo toda a extensão do conjunto.

As medições foram realizadas em microscópio binocular, acoplado a câmera de vídeo1. As medições foram feitas por meio de um programa de análise de imagem2 utilizando-se objetiva de 4 vezes e medindo-se o perfil interno e externo das cavidades e do septo interatrial. O sistema foi calibrado para mensuração em milímetros. Com este procedimento, relacionando os valores obtidos nos dois perfis, pretendeu-se indiretamente analisar o grau de irregularidade das superfícies interna e externa.